细菌定量杀灭试验
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1.目 的
在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上细菌繁殖体和细菌芽孢所需剂量，以验证实用消毒剂量。
2.试验器材
（1）按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽孢悬液或菌片。此外，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，准备其他菌种的悬液或菌片。
（2）消毒剂溶液除有特殊规定者外，应使用无菌硬水配制。消毒剂溶液浓度应以所含有效成份为准。例如，含氯消毒剂以所含有效氯浓度为准，碘伏以所含有效碘为准，过氧乙酸以所含过氧乙酸量为准，复方消毒剂浓度以主要杀菌有效成分含量为准。各组消毒剂溶液有效成份浓度的计算，应以试验菌与消毒剂的混合液中有效成份的最终浓度为准。
（3）去除残留消毒剂的中和剂或设备 （经鉴定试验证实合格的中和剂或有关器材）。
（4）消毒剂稀释用硬水：见附录A。
（5）有机干扰物质。悬液试验用3%BSA溶液，载体试验直接用TSB(见附录A)。
（6）TSA培养基：见附录A。
（7）含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（中和剂TSB），中和剂经鉴定合格。
（8）刻度吸管 （1.0ml、5.0ml）。
（9）恒温水浴箱。
（10）喷雾器（用于喷雾消毒试验）。
（11）电动混合器。
（12）秒表。
3.试验分组
试验中应分以下各组：
（1）试验组。按测试目的有两种选择。
第一种适用于消毒产品鉴定。根据本规范中表1-1和使用说明书，选定试验菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）以及3个作用时间（说明书指定最短作用时间，指定最短作用时间的0.5倍，指定最低作用时间的1.5倍。如说明书指定最短作用时间为20min，则应进行10min、20min、30min 三个时间）进行试验。
第二种适用于消毒产品监督机构日常监测。根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）以及一个作用时间（说明书指定最短作用时间）进行试验。
（2）阳性对照组。根据各种试验的规定，用稀释液代替消毒剂溶液，按上述同样的步骤进行试验。所得结果代表菌液原有浓度，以其作为计算杀灭对数的初始浓度。
4.悬液定量杀菌试验操作程序
（1）首先按产品说明书要求配制消毒液。无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为200mg/L，则应配制250mg/L），置20℃±1℃ 水浴备用。
（2）按照2.1.1.2 配制实验用菌悬液，浓度为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml。
（3）取消毒试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物质，混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。
（4）待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取0.5ml试验菌与消毒剂混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。
（5）各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸取 1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种 2 个平皿即可。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。
（6）同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。
（7）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
（8）试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值:
杀灭对数值 (KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度对数值（Nx）
计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于1时，其杀灭对数值，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。
5.载体浸泡杀菌试验操作程序
（1）载体浸泡定量杀菌试验操作程序
1）取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0ml 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。
2）将盛有消毒剂平皿置 20℃±1℃ 水浴箱内 5min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。
3）待菌药相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0ml 中和剂试管中。用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲 80 次，使菌片上的细菌被洗脱进入中和液中，再放置5min以上，使中和作用充分。最终进一步混匀后，吸取 1.0ml 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，测定存活菌数。
4）另取一平皿，注入 10.0ml 稀释液代替消毒液，放入 2 片菌片，作为阳性对照组。其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同。
5）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
6）试验重复 3 次 （包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按2.1.1.7.4（8）公式计算杀灭对数值。
（2）载体浸泡定性灭菌试验操作程序
1）取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片5.0ml的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。
2）将盛有消毒剂平皿置20℃±1℃水浴箱内5min后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片6片，（每个作用时间2片菌片）并使之浸透于消毒液中。
3）待试验菌与消毒液相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含5.0ml中和剂TSB试管中。用电动混合器混合20s，作为试验组样本。
4）另取一平皿，注入20.0ml硬水代替消毒液，放入4片菌片，作用至预定时间，取出2片，分别移入含5ml中和剂TSB试管中。其随后的试验步骤与上述试验组相同，作为阳性对照组样本。另取出2片，分别移入一含5.0ml中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲80次，然后用稀释液做10倍系列稀释，选择适宜稀释度，吸取1.0ml接种平皿，每管接种2个平皿，做活菌培养计数，作为菌数对照组样本。
5）所有试验样本均在37℃温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h，观察最终结果；对细菌芽孢需培养7d，观察最终结果。
6）试验重复5次（包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片）。
6.载体喷雾定量杀菌试验操作程序
（1）根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定1个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）和 3 个作用时间（说明书指定最短作用时间，指定最短作用时间的0.5倍，指定最低作用时间的1.5倍。如说明书指定最短作用时间为20min，则应进行10min、20min、30min 三个时间）进行试验。
（2）选定消毒剂的浓度与作用时间。每种菌所染菌片应分开进行试验。试验时，每种载体菌片各取 3 片，以等边三角形或三角形阵列，均匀排布于一未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内）。
（3）每批试验以同一浓度消毒剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷雾。每次喷雾的距离和压力保持一致，以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一致。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。
（4）待试验菌与消毒剂相互作用至各规定时间，取每种载体菌片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。
（5）吸取 1.0ml 上述洗液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管接种 2 个平皿。
（6）每批试验均应换一块未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板。喷雾器换装新浓度消毒剂前，应将原残留消毒剂洗净，再换装新浓度消毒剂。
（7）用硬水代替消毒液，按同样的喷雾方法进行处理，作为阳性对照组。如为压力罐装自动喷雾式气雾消毒剂，可直接用染菌载体作活菌计数，作为处理前阳性对照组。
（8）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
（9）试验重复 3 次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按2.1.1.7.4（8）公式计算杀灭对数值。
7.定量杀菌试验的评价规定
（1）产品监督检验，在产品说明书指定的最低浓度与最低作用时间，重复试验3次。要求悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均≥5.00，可判定为消毒合格。要求载体定量杀灭试验，各次的杀灭对数值均≥3.00，可判定消毒合格。
（2）产品申报卫生许可检验中，要求在产品说明书指定的浓度与3作用时间，重复试验3次。在产品指定最低浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数均应≥5.00。要求载体定量杀灭试验中，各次的杀灭对数均应≥3.00，可判定为消毒合格。在产品指定浓度与最短作用时间的0.5倍时，可容许对不同细菌或在部分重复次数中，出现不合格结果。
（3）对载体浸泡定性灭菌试验，阳性对照组应有菌生长，菌数对照组符合要求，阴性对照组应无菌生长，5次试验所有作用时间均无菌生长为灭菌合格。
（4）报告中应将各此试验的结果全部以表格的形式列出。阳性对照组应列出各次试验菌浓度，以及平均试验菌浓度。试验组应列出杀灭对数值，杀灭对数值大于5.00时，应表示为≥5.00，而不必列出具体的数字；杀灭对数值小于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。
8.注意事项
（1）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。
（2）试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查，发现有菌生长，则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。
（3）悬液定量杀菌试验时，有机干扰物质一般采用3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。如果某消毒剂使用说明书中指定，其产品只用于清洁物品或器械的消毒或只清洗消毒，可采用0.3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。
