真菌杀灭试验
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除垢剂/杀菌灭藻剂/预膜剂/缓蚀阻垢剂/粘泥剥离剂/密闭式缓蚀剂/聚丙烯酰胺/聚合氯化铝等
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1 目的
在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上真菌繁殖体或真菌孢子所需剂量，以验证对真菌及其孢子实用消毒剂量。
2试验器材
(1) 麦芽浸膏琼脂（MEA）：见附录A。
(2) 沙堡琼脂培养基：见附录A。
(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备
白色念珠菌ATCC 10231 和黑曲霉菌ATCC 16404 或孢子悬液与菌片按 2.1.1.9.3(1) 和 2.1.1.9.3(2) 所示方法制备。
此外，根据消毒剂特定用途和特殊需要，可选用其它真菌或孢子悬液与菌片。
（4）中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)。
（5）磷酸盐缓冲液( PBS， 0.03 mol/L，pH7.2)。
（6）消毒剂稀释用硬水：见附录A。
（7）有机干扰物质：见附录A。
（8）刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。
（9）恒温水浴箱。
（10）喷雾装置（用于喷雾消毒试验）。
（11）电动混合器。
（12）计时装置。
3 真菌悬液制备
（1）白色念珠菌悬液的制备
1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。将其密封后在4℃保存，时间不得超过6周。
2）试验时，取第3代斜面培养物在砂堡琼脂斜面上连续传代，方法与第3代相同。取第5代或6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。
3）悬液杀菌试验时，实验用菌悬液的含菌量为1×107cfu/ml～5×107cfu/ml；菌片制备按2.1.1.2 要求进行。
4）菌悬液保存在 4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。
5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。
（2）黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。
1) 取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细管吸取少量麦芽浸膏肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀物悬液加到含5.0ml麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置30℃±1℃培养42h～48h。用接种环划线接种第1代培养物于MEA培养基平板，置30℃±1℃培养箱中培养 42h～48h。取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养琼脂斜面培养基，置 30℃±1℃培养箱中培养 42h～48h，即为第3代培养物。将其密封后在4℃保存，时间不得超过9周。
2) 试验时，取第3代斜面培养物接种麦芽浸膏琼脂斜面，30℃培养48h，取得3.0~5.0ml麦芽浸膏肉汤，洗下斜面上的培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满 MEA 培养基表面，然后吸弃多余肉汤培养物液体，置 30℃±1℃ 培养 7d～9d。
3) 向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml～10.0ml 0.05%（V/V）吐温 80 生理盐水溶液，刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇 1min 后，滤过除去菌丝。滤过后，显微镜下（400 倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经 5000 r/min～6000 r/min，离心 20min。再次在显微镜下（400 倍）观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。
4) 黑曲霉分生孢子悬液在 2℃～8℃ 储存不能超过 2 d，使用前，混合均匀，在显微镜下（400 倍）观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。
5) 使用时，可用稀释液适当稀释。悬液试验时实验用菌悬液的含菌量为1×107 cfu/ml～5×107 cfu/ml。
6) 制备染菌样片时染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10μl。染菌后，置 37℃ 培养箱内干燥(约 30min)，或置室温下自然阴干后再使用。
7) 回收菌数应达5×105cfu/片～5×106cfu/片，可依试验要求确定。
4 试验分组
试验分为下列各组:
(1) 试验组，按2.1.1.7.3规定，选定消毒剂浓度与作用时间，对受试菌种的杀灭能力进行测定。
(2) 阳性对照组，以硬水代替消毒剂溶液，按2.1.1.7.3规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含试验菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对试验菌的杀灭对数值。
(3) 阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。
5 试验程序
常用杀灭试验有：悬液定量杀菌试验、载体浸泡定量杀菌试验、载体喷雾定量杀菌试验等。培养基对白色念珠菌为沙堡葡萄糖琼脂，对黑曲霉菌为麦芽浸膏琼脂（MEA）。其操作程序详见 2.1.1.7。
活菌培养计数时，对白色念珠菌，在37℃培养箱中培养48h 观察最终结果。对黑曲霉菌，在30℃培养箱中培养72h观察最终结果。
6 评价规定
(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次 ，对白色念珠菌和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均≥4.00，要求载体定量杀灭试验，各次试验的杀灭对数值均≥3.00，可判定该产品对真菌污染物消毒合格。
(2) 产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验3次，要求悬液定量杀灭试验在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品使用说明书规定使用浓度与最低作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，可判为实验室试验该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。
用载体浸泡定量杀灭试验评价杀菌效果时，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，可判为实验室试验该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。
7 注意事项
黑曲霉菌试验操作应在 Ⅱ 级生物安全柜内进行，避免造成环境污染和操作者受污染。
